Apoptoza dhe nekroza në organet rrethventrikulare pas hemorragjisë subaraknoidale eksperimentale siç zbulohet me aneksinë V dhe imuno-ngjyrosjen e kaspazës 3
Objektivat: Organet rrethventrikulare (CVOs)
të forta> janë thelbësore për shumicën e funksioneve autonome dhe endokrine. Trauma dhe gjakderdhja mund të ndikojnë në funksionin e tyre. Qëllimi i këtij studimi ishte të hetonte apoptozën dhe nekrozën në CVOs në periudhën e hershme pas hemorragjisë subaraknoidale eksperimentale (SAH) në minjtë, duke përdorur afinitetin e aneksinës V dhe imuno-ngjyrosjen e kaspazës 3.Metodat: U përdorën tre grupe eksperimentale: Ditët 1 dhe 2 pas SAH, dhe një grup kontrolli, nga shtatë minj albino Wistar secili. Hemorragjia subaraknoidale u realizua me punksion të arteries bazilare transklivale. Minjtë u perfuzuan me 0.9% NaCl dhe 0.1 M fosfat bufer pH 7.4 deri në ndalimin e zemrës. Apoptoza dhe nekroza në CVO u matën me citometri të rrjedhës me ngjyrosje me aneksinë V dhe me imunonjollim të kaspazës 3.
Rezultatet: Apoptoza në organum vasculosum lamina terminalis (OVLT) , eminenca mesatare (ME), dhe postrema e zonës (AP) ishte dukshëm më e lartë në grupin e ditës 1 sesa në grupin e kontrollit. Apoptoza në organin subfornicial (SFO), OVLT, ME dhe AP ishte dukshëm më e lartë në grupin e ditës 2 sesa në grupin e kontrollit. Kishte dallime domethënëse midis grupeve të ditës 1 dhe ditës 2, me përjashtim të AP. Nekroza në SFO dhe OVLTishte dukshëm më e lartë në grupin e ditës 2 sesa në grupin e ditës 1 ose të kontrollit, ndërsa nekroza në ME dhe AP nuk ndryshonte midis tre grupeve . Dendësia e qelizave të kapazës 3-pozitive ishte më intensive në grupin e ditës 2 sesa në grupin e ditës 1 dhe grupet e kontrollit.
Diskutim: Parandalimi i apoptozës mund të përmirësojë potencialisht funksionet e dëmtuara të CVO-ve pas SAH.
Hyrje
Apoptoza është vdekja e programuar qelizore, e cila ndryshohet në kushte patologjike si hemorragjia subaraknoidale (SAH) .1 Apoptoza besohet të jetë një faktor kontribues në patogjenezën e dëmtimit të hershëm të trurit,2 vazospazmës3 dhe infarkteve të trurit4 të parë pas SAH. Në literaturë, ka raporte të apoptozës 1,2,5,6 dhe nekrozës 7,8 pas SAH, dhe përmirësime në këto pas administrimit të frenuesve të apoptozës.5,6 Studimet kanë treguar d që frenimi i rrugëve apoptotike pas SAH jo vetëm reduktoi vdekjen qelizore
por gjithashtu rezultoi në një përmirësim të konsiderueshëm në rezultatin funksional,2,4 dhe kështu mund të ketë shtypur shumë nga dëmtimet dytësore të lidhura me SAH.1
Përveç shumë qendrave të vlefshme të trurit, një numër organesh rrethventrikulare shqisore (CVO), si organi nënfornicial (SFO) , organum vasculosum lamina terminalis (OVLT), postrema e zonës (AP) dhe eminenca mesatare (ME, një CVO sekretore), ndikohen nga SAH. fortë>9,10 Organet rrethventrikulare janë të pasura me neurotransmetues dhe nuk kanë një pengesë gjaku-tru.11,12
Aneksina V është treguar se ndërvepron fuqishëm dhe posaçërisht me fosfatidilserinë, dhe kështu mund të përdoret për të zbuluar apoptozën e hershme.15 Imunosngjyrimi me kaspazë 3 është një metodë tjetër që përdoret aktualisht për të zbuluar apoptozën në mostrat e indeve.16
Në këtë studim, ne hetuam praninë e hershme dhe të vonë apoptoza/nekroza nga afiniteti i aneksinës V dhe imunosngjyrimi i kaspazës 3 në CVO pas SAH eksperimentale në minjtë. Në rishikimin tonë të literaturës, nuk arritëm të gjenim ndonjë raport të mëparshëm që kishte të bënte me këtë temë.
Materiale dhe metoda
Protokolli i studimit u miratua nga Bu. Komiteti i Etikës së Kafshëve ¨lent Ecevit University.
Eksperimentet u kryen në Kirurgjinë Eksperimentale, Kërkimin dhe Laboratorin e Kafshëve të Universitetit Bu¨lent Ecevit, Fakulteti i Mjekësisë, Zonguldak, Turqi. Në total, 21 minj të rritur meshkuj Wistar albino, me peshë 200-300 g, u përfshinë në studim. Të gjithë minjtë u mbajtën në 22-25uC me lagështi të përshtatshme, në një cikël dritë/errësi prej 12/12 orësh dhe iu dhanë lëngje dhe ushqim ad libitum. Minjtë u ndanë në tre grupe si më poshtë: Dita 1 pas SAH (n 5 7), Dita 2 pas SAH (n 5 7) dhe kontrollet (n 5 7).
Minjtë u anestezuan me injeksion intraperitoneal të ketaminës (60 mg/kg) dhe ksilazine (10 mg/kg). SAH eksperimentale u realizua me një teknikë të ngjashme me atë të përshkruar nga Barry et al.,17 e cila është përshkruar më parë. mikroskop (Takagi OM-5, Japoni) dhe klivusi u ekspozua duke përdorur qasjen parafaringeale anteriore. Windo kockore w para arteries bazilare u krijua duke përdorur gjilpëra me vrima të mëdha, duke u kujdesur jashtëzakonisht për të mos hapur cisternën prepontine. Një gjilpërë suture me një diametër të jashtëm 75 mm (Ethicon, Livingston, MB) u fut në arterien bazilare. Tërheqja e gjilpërës shkaktoi hemorragji të gjerë në hapësirën subaraknoidale, me një shpërndarje të barabartë deri në zonën e nuhatjes. Minjtë u mbajtën gjallë për 1 dhe 2 ditë pas SAH në kushte të përshtatshme.
Minjtë u eutanizuan me perfuzion. Nën anestezi u krye torakotomia, më pas u bë kanulimi i barkushes së majtë, kapja e aortës zbritëse, prerja e atriumit të djathtë dhe larja e gjakut nga koka dhe rajonet e qafës së mitrës me 0,9% NaCl dhe 0,1 M fosfat bufer (pH 74). derisa zemra ndaloi. Kafshëve iu pre koka dhe mostrat e SFO, OVLT, ME dhe AP u morën duke përdorur një atlas stereotaksik të miut (Paxinos & Watson).
Parimi i metodës së aneksinës V. është për të matur me citometri të rrjedhës afinitetin e aneksinës V ndaj fosfatidilserinës, e cila zhvendoset nga membrana e brendshme e plazmës në fletën e jashtme gjatë
apoptozës. 15 Qelizat u morën nga CVOs veçmas. Ne përdorëm 100 ml suspension qelizor për çdo mostër. Aneksina V e konjuguar me izotiocianat fluorescein (FITC)-qeliza apoptotike të ngjyrosura në prani të jodidit propidium (PI). Ky reaksion mundëson zbulimin e fosfatidilserinës në sipërfaqen e qelizave apoptotike. Të dyja qelizat PI-pozitive dhe aneksina V-pozitive treguan status nekrotik në përqindje. Ne përdorëm një komplet komercial aneksin-FITC (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, SHBA) në përputhje me udhëzimet e prodhuesit dhe një Coulter FC500 > citometri i rrjedhës (Beckman-Coulter). Në Fig. 1. Qelizat PI-pozitive dhe aneksinë V-pozitive tregojnë apoptozë ose nekrozë të vonë (Fig. 1).
Për analizën histopatologjike dhe imunohistokimike, CVOs Të marra nga truri i minjve u përdorën për të gjitha grupet. Mostrat e organeve rrethventrikulare nga secili miu u fiksuan në 10% zgjidhje neutrale të formalinës dhe më pas u futën në dyll parafine. Seksionet u prenë në një kriostat në 5-6 mm trashësia Seksionet e indeve më pas u depiluan dhe u ngjyrosën me hematoksilin dhe eozinë (H&E) dhe cresyl violet për analiza histomorfologjike. Organet rrethventrikulare u vlerësuan nën një mikroskop drite nga një patolog i vetëm(FB)i verbër ndaj grupeve të studimit. Analiza imunohistokimike duke përdorur antitrupin poliklonal antikaspase 3(CPP32) (Neomarkers, Cat #RB-1197R7, Fremont, CA, USA)u krye gjithashtu për të vlerësuar apoptozën. Imuno-ngjyrosja u bazua në teknikën komplekse të streptavidin biotin peroxidase me marrjen e antigjenit në mikrovalë duke përdorur inde të ngulitura në dyll parafine të fiksuar me formalinë. Seksionet e ngulitura me dyll u mblodhën në rrëshqitje dhe më pas u depiluan dhe u rihidratuan. Pas depilimit, seksionet u trajtuan me 10% peroksidazë hidrogjeni në ujë të filtruar për të bllokuar aktivitetin endogjen të peroksidazës. Për marrjen e antigjenit, rrëshqitjet u zien me tampon citrat 10 mmol/L (pH 7) për 10 minuta në një mikrovalë. Më pas, rrëshqitjet u inkubuan me antisera parësorë, duke përfshirë antitrupat poliklonalë të lepujve kaspase 3 (Neomarkers, Cat #RB1197-R7, Fremont, CA, USA). Pas larjes në solucion të kripur të buferuar me fosfat, indet në rrëshqitje u inkubuan me një antitrup dytësor të konjuguar me biotinë, e ndjekur nga inkubimi në përbërësit e sistemit të biotinës streptavidin për 30 minuta në temperaturën e dhomës. Reaksionet u bënë të dukshme pas zhytjes së mostrave në tetrahidroklorur 3,39-diaminobenzidine (DAB; Lab Vision, Fremont, CA, SHBA). Më pas, seksionet u lyen me hematoksilin, më pas shpëlahen dhe montohen. Kontrolli negativ kishte hequr antitrupin primar dhe indi i bajameve u përdor si kontroll pozitiv. Imunoreaktiviteti i kapaszës 3 u vu re kryesisht në citoplazmë me disa ngjyrosje bërthamore. Sllajdet u vlerësuan në mënyrë të verbër nga një patolog i vetëm (FB). Apoptoza, e matur nga dendësia e qelizave kaspase 3 pozitive, u vlerësua në CVO për secilin grup.
Analiza Statistikore
Paketa Statistikore për Shkenca Sociale. (versioni 19.0; SPSS Inc, Chicago, IL, USA) u përdor për të gjitha analizat e të dhënave. Rezultatet u shprehën si mesatare dhe diapazon. Testi Shapiro-Wilk u përdor për testimin e normalitetit për variablat pa shpërndarje normale dhe testi Kruskal-Wallis u përdor për krahasime midis tre grupeve. Testi Conover ishte përdoret për krahasime post hoc. Për të gjitha krahasimet statistikore, 0.05 u konsiderua statistikisht.
Rezultatet
Gjetjet citometrike të rrjedhës janë përmbledhur në Tabelën 1. Grafikët e marra nga PI/aneksina V domethënëse. Analiza e citometrisë së rrjedhës së SFO, OVLT, ME dhe AP (grupet e kontrollit dhe të ditës 2) janë dhënë në Fig. 2. Në grupin e ditës 1, rezultatet e hershme të apoptozës, të paraqitura si mesatare (varg), ishin si më poshtë: OVLT 0.50% (0.08-1.89), ME 0,55% (0,21–0,84) dhe AP 0.46% (0,20–1,86), apoptoza nëSFO nuk ndryshonte ndjeshëm nga ai në grupin e kontrollit. Për grupin e ditës 2, apoptoza e hershme ishte si më poshtë: SFO 1.88% (0.97-2.99), OVLT 1.85% (0.77-3.16), ME 0.79% (0.54-1.43) dhe AP 0.82% (0.19-1.49 ). ), e cila ishte dukshëm më e lartë në të katër fushat sesa në grupin e kontrollit. Në grupin e kontrollit, apoptoza e hershme ishte0.12% (0.02-0.35) në SFO, 0.15% (0.04-0.71)në OVLT, 0.18% (0.09-0.34) > në ME, dhe 0.06% (0.01–0.24) në AP.
Nekroza në SFO dhe OVLT në grupin e ditës 2 ishte dukshëm më i lartë se në grupet e ditës 1 dhe të kontrollit, dhe rezultatet për ME dhe AP nuk ndryshonte midis grupeve të ditës 1 dhe grupeve të kontrollit
Ekzaminimi histopatologjik i seksioneve SFO, OVLT, ME, dhe AP shfaqi humbje më të dukshme të qelizave në grupin e ditës 2 sesa në grupet e tjera.
Densiteti i qelizave pozitive të kaspazave 3 ishte më intensiv në grupin e ditës 2 sesa në dy grupet e tjera. Kishte pak qeliza kaspase 3 pozitive në grupin e kontrollit dhe grupi i ditës 1 kishte më pak qeliza kaspase 3 pozitive sesa grupi i ditës 2.
Diskutim
Apoptoza është një nga mekanizmat në evolucionin e vdekjes qelizore, e cila mund të shihet pas SAH klinike dhe eksperimentale.
Në këtë studim të CVO-ve fortë>pas SAH, eksperimentale te minjtë, apoptoza u pa në SFO, OVLT, AP, dhe ME. Në grupin e studimit të ditës 1, ne gjetëm afinitet të rritur të aneksinës V ndaj fosfatidilserinës (apoptozë e hershme)në të gjitha CVO përveç SFO. Në ditën 2 g
Lexo: 0
